凍存管冷凍步驟:

　　1、用預熱的PBS溶液洗滌細胞，吸取溶液，含有胰蛋白酶和EDTA的溶液覆蓋細胞(薄薄的液層足夠，胰蛋白酶和EDTA的濃度需要根據細胞系確定)。

　　2、37℃孵育細胞3-5分鐘。

　　3、細胞從底部脫離之后，終止孵育，加入含有血清的培養(yǎng)基，用移液器輕輕地懸浮細胞。

　　4、離心細胞懸液(500xg,5分鐘)，用含有血清的培養(yǎng)基重新懸浮。

　　細胞計數

　　1、離心細胞懸液(500xg,5分鐘)，去除上清液，用適量體積的含有血清的培養(yǎng)基重新懸浮細胞。

　　2、以1:1體積比混合細胞和凍存液(60%培養(yǎng)基，20%胎牛血清，20%DMSO)，然后轉移到凍存管中。凍存的細胞密度為1-5×106個/毫升。

　　3、含有細胞的凍存管建議以?1K/min的速率降溫，可以將凍存管置于?70℃含有異丙醇的容器中。如果凍存管存儲其他樣品，可以直接放置在?20℃，?70℃或者液氮的氣相。為了確保樣品冷凍均勻，4mL和5mL的凍存管需要先置于在?20℃冰箱過夜，然后再轉移到?70℃或者液氮的氣相。

　　4、然后轉移凍存管到液氮罐。為了避免污染(如支原體)和安全考慮，請將凍存管置于液氮的氣相，切勿置于液相。

　　操作凍存管復蘇，全程使用安全防護設備，建議穿實驗服、戴棉質手套且在安全的實驗臺上進行操作。條件允許情況下，請佩戴護目鏡或防護面罩。由于夏季室內溫度會高于冬季，請格外小心。凍存細胞儲存過程中，凍存管的冷凍溫度須均勻。不均勻的受凍將會導致冰塞的產生，冰塞會抑制兩側的液體溫度傳遞進而產生危險的高壓力并導致凍存管受損。